中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒
- 概要
T2毒素(T2)是由多種鐮刀菌產生的一種霉菌毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品,對人類健康及畜牧業構成了較大危害。T-2毒素主要影響血液,肝臟,腎臟,胰腺肌肉及淋巴細胞的功能,T-2毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭食、嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經機能障礙等。使用T2毒素試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中T2毒素殘留。
- 原理
測定的基礎是抗原-抗體反應。微孔板上包被有偶聯抗原。分別加入T2毒素標準品或樣品、酶標記物和抗體于微孔中,樣品/標準品競爭結合抗體,酶標記物可與一抗結合,再于酶標版上的包被抗原結合。反應洗滌后,加入TMB底物顯藍色,加入終止液后顏色由藍變黃,用酶標儀在450nm處檢測,吸光值與樣品中T2毒素含量成負相關,與標準曲線比較即可得出T2毒素的含量。
- 試劑盒的組成
- 包被有抗原的96微孔板:1塊(96 孔,12條×8 孔)
- T2毒素標準品:0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL 1 瓶 × 1.0mL
- T2抗體 1瓶 ×10mL
- 酶標記物 1 瓶 ×10mL
- 10× 濃縮洗滌液: 1瓶 × 50mL
- T2稀釋緩沖液A: 1瓶 × 50mL
- T2稀釋緩沖液B: 1瓶 × 50mL
- 顯色底物TMB: 1瓶 × 17mL
- 終止液: 1瓶 × 7mL
- 試劑盒說明書: 1份
- 質檢報告: 1份
- 需要的儀器、試劑
1)儀器
- 酶標儀450nm(iELisa全自動酶標儀或相當者)
- 微量移液器:20μL-200μL單道,100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
- 多功能旋轉混合器(或者搖床、高速均質器)
- 酶標板振蕩器
- 渦旋混合器
- 50mL離心管
- 1.5mL離心管
- 定性濾紙
- 過濾漏斗
- —天平:感量0.01g
- 試劑
- 樣品提取液70%甲醇:取700mL甲醇,加300mL純水,混勻。
- 樣品處理
5.1谷物(玉米、小麥、高粱、大米、大豆):
- 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中,加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉混合器上振蕩30分鐘(或使用高速均質器均質3分鐘,或搖床上振蕩40分鐘)。
- 將提取液用普通濾紙過濾,吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中,加入900μL T2稀釋緩沖液A,用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數:50
5.2飼料:
- 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中,加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉混合器上振蕩30分鐘(或使用高速均質器均質3分鐘,或搖床上振蕩40分鐘)。
- 將提取液用普通濾紙過濾,用0.22μm有機系濾膜過濾后,取100μL濾液置于1.5mL離心管中,加入900uL T2稀釋緩沖液B,用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數:50
6. 酶聯免疫分析程序
6.1測定之前注意事項
- 使用前將所有試劑平衡至室溫(20-25℃)。
- 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分析中的再現性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有溫育過程應避免陽光直射,并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。
6.2溶液的配制
- 提取液的配制: 根據實驗所需的量配制70%的甲醇水溶液(水要用純水、或蒸餾水、去離子水)
- 洗滌液的配制:將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。(例如:取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測)。
6.3測定程序
- 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架,標準品和樣品做兩個平行實驗,記錄下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
- 分別吸取50μL標準品和樣品加至相應的微孔(雙孔)中,然后再各加入50μL的酶標記物,后加入50μL的T2抗體,裝入袋中密封,室溫(25℃)溫育20分鐘。
- 倒出孔中的液體,每孔加入250μL稀釋好的洗滌液洗滌,重復操作四次。洗板時每次間隔30s,洗完后用力在吸水紙上排干。
- 每孔加入100μL顯色底物,避光室溫(25℃)溫育10分鐘。
- 每孔加入50μL終止液,混勻。
- 置于酶標儀中,振蕩混勻,在450nm處測定吸光度值(OD值),參比波長630nm。(iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值)。
7. 結果判定
1)所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以DI個標準(0標準)的吸光度值(B<蘇b>0蘇b>)再乘以100%,即百分吸光度值。
百分吸光度值(%)= | B | ×100% |
B<蘇b>0蘇b> |
以T2毒素標準品濃度值(ppb)為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法,計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件,更便于大量樣品的快速分析。
- 樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應稀釋倍數。
- 如果測定值超出檢測范圍,樣品提取溶液按一定的比例用70%甲醇進行稀釋。
8. 注意事項
- 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫(20- 25℃)會導致數值偏低。
- 在洗板過程中如果出現板孔干燥過久的情況,則會出現標準曲線不成線性,重復性不好的現象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。
- 標準物質和顯色液對光敏感,避免直接暴露在光線下。
- 混合要均勻,洗板要*(包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻)。
- 終止液為強酸性物質,避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效期的試劑盒,也不要混合使用不同批次的試劑盒,這樣會引起測定結果不準確。
- 試劑盒的儲存條件是2-8℃,切勿冷凍。
9. 中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒的性能指標
- 檢測限LOD: 谷物10ppb(μg/kg),飼料15ppb,(LOD:空白樣品測定值+2倍標準偏差SD)
- 定量限LOQ: 谷物25ppb,飼料30ppb。
- 定量檢測范圍:谷物25-1000ppb,飼料30-1000ppb。